Abstrak - Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh berbagai macam limbah selulosa terhadap kualitas enzim selulase yang dihasilkan kapang Aspergillus sp koleksi laboratorium biologi Universitas PGRI Madiun. Kualitas enzim diukur berdasarkan data kadar protein yang diperoleh. Metode penelitian yang dipakai adalah eksperimen yang menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 2 faktorial dengan 3 kali pengulangan. Perlakuan dalam penelitian ini adalah S (jenis substrat) yaitu limbah daduk (Sd), limbah seresah Jerami kacang tanah (Sr), limbah Bonggol jagung (Sj) dan W(waktu inkubasi) dengan variasi W₁ ( 3 hari), W₂ (5 hari), W₃ (7 hari) dan W₄ (10 hari) Data kandungan protein dari kapang Aspergillus niger diperoleh dengan menggunakan metode BIURET kemudian data dianalisis dengan menggunakan anava dua jalur kemudian di uji lanjut dengan uji BNJ. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh bahwa enzim yang diproduksi dengan substrat jerami kacang tanah (Sr) pada waktu inkubasi 10 hari (W₄) (SrW₄) menghasilkan kadar protein tertinggi dengan rata-rata sebesar 1.44±0.15 μg/mL, sedangkan enzim dengan kadar protein terendah diproduksi pada substrat tongkol jagung (Sj) pada waktu inkubasi 3 hari (W₁) (SjW₃) dengan kadar protein sebesar 0.29±0.02 μg/mL.